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據(jù)統(tǒng)計(jì)，2021年，全球葡萄種植面積達(dá)到734×104hm2，葡萄酒產(chǎn)量超過(guò)2500×107L。葡萄酒生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)廢水主要來(lái)源于加工設(shè)備的清洗和殘液的排出，這些廢水中含有大量由醇、糖和有機(jī)酸組成的溶解性有機(jī)物、微量營(yíng)養(yǎng)素、多酚類(lèi)化合物。受葡萄生長(zhǎng)周期的影響，在9-11月，葡萄酒釀制高峰期所產(chǎn)生的廢水量及廢水中的有機(jī)物濃度增加明顯。綜上，葡萄酒生產(chǎn)廢水總體呈酸性，色度和有機(jī)物濃度高，可生化性好，但水質(zhì)、水量季節(jié)性波動(dòng)明顯。

厭氧消化作為一種能高效降解有機(jī)質(zhì)的技術(shù)，被廣泛用于葡萄酒生產(chǎn)廢水的預(yù)處理過(guò)程。厭氧序批式生物膜反應(yīng)器(AnSBBR)兼?zhèn)渖锬しā⑿蚺椒磻?yīng)器的優(yōu)點(diǎn)。生物膜法通過(guò)載體富集微生物，從而增加了反應(yīng)器中生物質(zhì)的濃度和多樣性，提高了系統(tǒng)的抗沖擊能力。序批式工藝不僅自動(dòng)化程度高，還存在周期性循環(huán)和完全混合的特性，從而提高了抗沖擊能力。目前，AnSBBR優(yōu)異的處理性能和抗沖擊能力已在生物柴油、甘油和金屬加工等多種廢水的處理研究中得以證實(shí)，但其對(duì)葡萄酒生產(chǎn)廢水的處理負(fù)荷和消化性能尚不明確。

通常，較低的有機(jī)負(fù)荷(OLR)雖利于反應(yīng)器的運(yùn)行穩(wěn)定，但增加了運(yùn)行成本；而高OLR雖有助于有機(jī)物利用，但易導(dǎo)致系統(tǒng)酸化。故通過(guò)逐步提高OLR探索AnSBBR處理葡萄酒生產(chǎn)廢水所能承受的最大OLR尤為重要。目前，厭氧反應(yīng)器在不同OLR下處理葡萄酒生產(chǎn)廢水的研究主要是OLR對(duì)消化性能的影響。然而，微生物對(duì)環(huán)境變化敏感，高OLR下導(dǎo)致反應(yīng)器運(yùn)行失敗的原因是破壞了體系中菌群結(jié)構(gòu)的平衡。因此，有必要深入探究OLR變化對(duì)菌群結(jié)構(gòu)的影響。

本研究采用AnSBBR處理模擬葡萄酒生產(chǎn)廢水，通過(guò)監(jiān)測(cè)AnSBBR各OLR運(yùn)行期間出水水質(zhì)、甲烷產(chǎn)量和產(chǎn)甲烷活性等來(lái)評(píng)估AnSBBR處理葡萄酒生產(chǎn)廢水的性能，利用高通量測(cè)序?qū)ι锬んw系中群落結(jié)構(gòu)的演替規(guī)律進(jìn)行解析，確定AnSBBR處理葡萄酒生產(chǎn)廢水的最佳工況條件，旨在為推動(dòng)AnSBBR的工程化應(yīng)用提供依據(jù)。

1、材料與方法

1.1 接種污泥和進(jìn)水

實(shí)驗(yàn)所用生物膜填料和活性污泥取自西安市第四污水廠缺氧池，生物膜載體為K3填料(直徑25mm，比表面積500m2·m?3)，填料上掛膜量為2507.6mg·m?2，反應(yīng)器中生物填充率為35%。使用4L活性污泥(5677.5mg·L?1)用于掛膜。進(jìn)水用實(shí)際葡萄酒水稀釋配制，葡萄酒COD為(220450±2100)mg·L?1，總磷為(26.1±1.3)mg·L?1，總氮為(1479±37)mg·L?1，乙酸為(1409.6±13.8)mg·L?1，多糖為(2524.84±65.37)mg·L?1，蛋白質(zhì)為(17899.47±203.31)mg·L?1，pH為3.99±0.2，投加碳酸氫鈉控制進(jìn)水pH為7.3~7.5。

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置與運(yùn)行

實(shí)驗(yàn)所用AnSBBR有效容積為10L，φ270mm×360mm。采用蠕動(dòng)泵間歇進(jìn)水、推流泵攪拌，控制溫度為(35±1)℃，進(jìn)出水和攪拌采用可編程控制器(PLC)控制，產(chǎn)生的沼氣流入濕式氣體流量計(jì)。

AnSBBR運(yùn)行過(guò)程分為馴化啟動(dòng)、強(qiáng)化和穩(wěn)定3個(gè)階段，實(shí)驗(yàn)期間進(jìn)水COD、水力停留時(shí)間和有機(jī)負(fù)荷見(jiàn)表1。反應(yīng)器采取低負(fù)荷啟動(dòng)，起始COD為(1±0.1)g·L?1，通過(guò)縮短HRT提高有機(jī)負(fù)荷以完成對(duì)生物膜的馴化培養(yǎng)，處理后的廢水用于灌溉時(shí)，需滿足農(nóng)田灌溉標(biāo)準(zhǔn)(GB5084-2021)中旱作物對(duì)COD排放的要求(COD<200mg·L?1)。強(qiáng)化階段，根據(jù)BEZERRA等的方法提升OLR。強(qiáng)化和穩(wěn)定階段的運(yùn)行周期為4h(包括進(jìn)水5min、反應(yīng)230min、出水5min)，進(jìn)水體積為2L。

1.3 產(chǎn)甲烷速率測(cè)試

產(chǎn)甲烷速率測(cè)試能夠評(píng)估厭氧污泥的產(chǎn)甲烷潛力，分別在3種負(fù)荷(1.2、5.4、9.6g·(L·d)?1))下和接種污泥中進(jìn)行。生物膜填料用PBS清洗3次后，加入250mL厭氧瓶中，再加入150mL營(yíng)養(yǎng)液。氮吹5min以排出瓶中空氣，將厭氧瓶置于35℃水浴搖床，用排水集氣法測(cè)定甲烷，并配制2mol·L?1NaOH溶液，吸收H2S和CO2。最后利用Gompertz模型方程對(duì)產(chǎn)甲烷過(guò)程進(jìn)行擬合分析，模型方程見(jiàn)式(1)。

式中：Pt為t時(shí)刻累積甲烷產(chǎn)量，mL·g?1(以TS計(jì))；Pmax為最大甲烷產(chǎn)量，mL·g?1(以TS計(jì))；Rmax為最大甲烷產(chǎn)率，mL·(g·h)?1(以TS計(jì))；e=2.7183；λ為停滯時(shí)間，h。

1.4 分析項(xiàng)目及方法

1)理化指標(biāo)分析。

采用哈希(DRB-200)消解儀消解COD；采用雷磁PHS-3C測(cè)定pH；采用濕式氣體流量計(jì)(LMF-1)計(jì)量沼氣；采用標(biāo)準(zhǔn)方法分析TS、VS；聯(lián)合滴定法測(cè)定總堿度(TA)、部分堿度(PA)，pH滴定終點(diǎn)分別3.8和5.75，碳酸氫鹽堿度(BA)為1.2PA；采用FID-氣相色譜儀(SP-3420A)測(cè)定VFAs；采用TCD-氣相色譜儀(SP-3420A)測(cè)定沼氣組分；參照LI等的熱提法提取胞外聚合物(EPS)并分別用苯酚硫酸法和福林酚法測(cè)定多糖(PS)和蛋白質(zhì)(PN)；參照趙陽(yáng)等的方法測(cè)定輔酶F420濃度；參照Z(yǔ)HAO等的方法測(cè)定INT-ETS；參照李韌等的方法測(cè)定生物膜量。

2)高通量測(cè)序。

取接種和反應(yīng)器3種負(fù)荷(OLR為1.2、5.4和9.6g·(L·d)?1)的生物膜污泥，運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。細(xì)菌和古菌用帶有barcode特異性引物515FmodF(5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806RmodR(5′-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′)，針對(duì)全菌16SrRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增并利用Illumina公司的MiseqPE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。使用IBMSPSS25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，采用t檢驗(yàn)，顯著性水平為P<0.05差異顯著。

2、結(jié)果與分析

2.1 AnSBBR運(yùn)行效果分析

1)AnSBBR的運(yùn)行特性。反應(yīng)器連續(xù)運(yùn)行的效果見(jiàn)圖1。反應(yīng)器經(jīng)37d馴化培養(yǎng)后，COD去除率由(52.2±17.4)%增至(75±12.2)%，出水COD降至(171±30)mg·L?1，滿足了農(nóng)田灌溉標(biāo)準(zhǔn)(GB5084-2021)中旱作物對(duì)COD值的要求，表示AnSBBR啟動(dòng)成功。強(qiáng)化運(yùn)行階段(OLR為1.2~9.6g·(L·d)?1)，COD去除率(圖1(a))由81.6%增至97.7%，沼氣產(chǎn)量(圖1(b))由0.37L·(L·d)?1增至4.6L·(L·d)?1。pH在6.8~7.8內(nèi)，TVFA為66~193mg·L?1，總堿度為780~1520mg·L?1；穩(wěn)定運(yùn)行階段(OLR為9.6~10.2g·(L·d)?1)，當(dāng)OLR為10.2g·(L·d)?1時(shí)，出水COD最大，達(dá)到675mg·L?1，COD去除率降至94.9%，甲烷產(chǎn)率降至(332.4±28.7)mL·g?1，TVFA為532mg·L?1。隨后OLR降至9.6g·(L·d)?1，運(yùn)行16d后，反應(yīng)器各項(xiàng)運(yùn)行參數(shù)重新恢復(fù)正常?？梢钥闯?，AnSBBR處理OLR為1.2~9.6g·(L·d)?1的葡萄酒生產(chǎn)廢水時(shí)，具備優(yōu)異的處理性能。

圖1 連續(xù)運(yùn)行下AnSBBR的性能表現(xiàn)

2)OLR對(duì)AnSBBR性能及穩(wěn)定性的影響。有機(jī)物降解及甲烷產(chǎn)量是評(píng)價(jià)厭氧反應(yīng)器消化效率的重要指標(biāo)。OLR對(duì)反應(yīng)器性能及穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖2。OLR超過(guò)2.4g·(L·d)?1后，COD去除率維持在較高的水平(>96%)(圖2(a))。當(dāng)OLR為1.2~5.4g·(L·d)?1時(shí)，甲烷產(chǎn)率隨OLR的提升而增加，OLR超過(guò)5.4g·(L·d)?1后甲烷產(chǎn)率隨OLR的提升而減少。當(dāng)OLR為5.4g·(L·d)?1時(shí)，甲烷產(chǎn)率最大，達(dá)到(349.9±7.6)mL·g?1。對(duì)比穩(wěn)定階段前后結(jié)果，可以看出，重新恢復(fù)后的反應(yīng)器在COD去除率和甲烷產(chǎn)率方面表現(xiàn)更好。此外，與其他厭氧反應(yīng)器對(duì)比，可以看出，AnSBBR在出水COD和甲烷產(chǎn)率方面更具優(yōu)勢(shì)(表2)。

圖2 OLR對(duì)AnSBBR的性能及穩(wěn)定性的影響

系統(tǒng)的緩沖能力是評(píng)估反應(yīng)器運(yùn)行穩(wěn)定性的關(guān)鍵指標(biāo)，其變化受消化過(guò)程中堿度和VFAs的共同影響。當(dāng)OLR為10.2g·(L·d)?1時(shí)，pH降至7.0以下，但總堿度波動(dòng)較小(圖1(c))，TVFA/TA<0.4(圖2(b))。這是因?yàn)樘妓釟潲}堿度被消耗轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性脂肪酸堿度，但后者不能提供緩沖，從而出現(xiàn)pH降低但總堿度變化小的情況。這說(shuō)明，TVFA/TA無(wú)法準(zhǔn)確表示體系緩沖能力的變化情況，故再引入TVFA/BA。通常，在高OLR下，TVFA/BA<0.4時(shí)，系統(tǒng)處于穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)OLR為1.2~9.6g·(L·d)?1)時(shí)，比值低于0.4，反應(yīng)器緩沖能力良好(圖2(b))；當(dāng)OLR為10.2g·(L·d)?1)時(shí)，比值增至(0.81±0.13)，反應(yīng)器酸化風(fēng)險(xiǎn)激增。此時(shí)，乙酸增至(366.18±27.79)mg·L?1，丙酸為(51.63±10.35)mg·L?1，丁酸為(30.44±6.52)mg·L?1(圖2(d))，且體系中VFAs呈現(xiàn)出繼續(xù)增加的趨勢(shì)，表明反應(yīng)器無(wú)法適應(yīng)OLR為10.2g·(L·d)?1的運(yùn)行條件。

2.2 生物膜體系特性

1)生物膜量。微生物利用有機(jī)物代謝并在填料表面聚集形成生物膜，并通過(guò)脫落更新來(lái)穩(wěn)定生物量。OLR對(duì)生物量的影響見(jiàn)圖3。與接種污泥相比，當(dāng)OLR為1.2g·(L·d)?1)時(shí)，生物量為1802.8mg·m?2，減少了28.0%(圖3(a))，這是部分原有微生物無(wú)法適應(yīng)新環(huán)境導(dǎo)致的死亡脫落。在OLR從1.2g·(L·d)?1增至9.6g·(L·d)?1后，生物膜量由1802.8mg·m?2增至7108.8mg·m?2。這不僅得益于廢水中有機(jī)物易被微生物代謝利用，還因序批式工藝存在“吸收-儲(chǔ)存-利用”的特性，促進(jìn)了微生物的增殖。

圖3 OLR對(duì)掛膜生物量，輔酶F420和INT-ETS活性的影響

輔酶F420是產(chǎn)甲烷菌特有的一種低電位電子載體。REYNOLDS等認(rèn)為，輔酶F420由氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌分泌，其濃度可反映產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量或產(chǎn)甲烷活性。INT-ETS活性指微生物的電子傳遞速率，反映厭氧微生物的活性。輔酶F420濃度和INT-ETS活性隨負(fù)荷的提升而增加(圖3(b))，在OLR從1.2g·(L·d)?1增至5.4g·(L·d)?1期間，輔酶F420濃度和INT-ETS活性增加最為明顯，分別增加了115.2%和102.9%。

圖4反映了OLR對(duì)產(chǎn)甲烷速率的影響。使用Gompertz模型對(duì)結(jié)果進(jìn)行擬合，結(jié)果見(jiàn)表3。針對(duì)特定的廢水，接種污泥對(duì)其降解的能力不足，甲烷產(chǎn)量和產(chǎn)甲烷速率分別為19.16mL·g?1和2.83mL·(g·h)?1。馴化后甲烷產(chǎn)量顯著增加，達(dá)到67.95mL·g?1，產(chǎn)甲烷速率為34.44mL·(g·h)?1。當(dāng)OLR為9.6g·(L·d)?1時(shí)，產(chǎn)甲烷速率最大，為59.36mL·(g·h)?1，累計(jì)甲烷產(chǎn)量達(dá)到了172.68mL·g?1?？梢钥闯?，生物膜的產(chǎn)甲烷速率隨OLR的提升而提高，在OLR從1.2g·(L·d)?1增至5.4g·(L·d)?1期間，產(chǎn)甲烷速率提高較明顯，產(chǎn)甲烷速率和甲烷產(chǎn)量分別提高了68.0%和125.8%。

圖4 OLR對(duì)產(chǎn)甲烷速率的影響

總體來(lái)看，生物膜量、輔酶F420濃度、INT-ETS活性和產(chǎn)甲烷速率隨OLR的提升呈現(xiàn)不同程度的增加，但是在較高OLR下，增加速率明顯減緩。這說(shuō)明，逐級(jí)提升OLR的運(yùn)行策略可促進(jìn)相關(guān)功能菌的富集，并加快微生物對(duì)基質(zhì)的利用速率。但由于產(chǎn)甲烷菌屬對(duì)OLR的適應(yīng)范圍存在差異，過(guò)高的OLR對(duì)部分產(chǎn)甲烷菌生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)生抑制，導(dǎo)致后續(xù)OLR提升過(guò)程對(duì)生物膜體系的促進(jìn)效果削弱。

2)EPS特性。生物膜體系中胞外聚合物是實(shí)現(xiàn)微生物與載體、微生物與微生物之間黏附的關(guān)鍵，通過(guò)細(xì)胞分泌、脫落和外部吸附等途徑形成，主要由蛋白質(zhì)和多糖組成。EPS空間結(jié)構(gòu)包括溶解態(tài)EPS(Slime-EPS)、松散型EPS(LB-EPS)和緊密型EPS(TB-EPS)。馴化成功后的Slime-EPS和TB-EPS濃度相較于接種污泥明顯增加，Slime-PN和Slime-PS濃度分別提高了291.0%和103.0%，TB-PN和TB-PS濃度分別提高了58.5%和75.1%(圖5)。當(dāng)原有微生物因無(wú)法適應(yīng)新環(huán)境死亡脫落后被吸附在生物膜表面，從而使EPS最外層的Slime-EPS濃度明顯增加。TB-EPS是與細(xì)胞緊密結(jié)合的聚合物，當(dāng)反應(yīng)器成功啟動(dòng)時(shí)，TB-EPS濃度的增加，有利于微生物聚集體的黏附聚集以及維持聚集體空間結(jié)構(gòu)和功能的完整。隨后，微生物代謝增殖消耗EPS表面吸附的過(guò)量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)使得OLR為5.4g·(L·d)?1時(shí)EPS濃度降低。

圖5 OLR對(duì)EPS質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其蛋白質(zhì)和多糖濃度的影響

EPS存在于污泥表面，當(dāng)環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，其組成成分更易受到影響。各層EPS中PN/PS比值隨負(fù)荷的提升而增加，當(dāng)OLR為9.6g·(L·d)?1時(shí)，Slime-PN/PS、LB-PN/PS和TB-PN/PS比值分別達(dá)到了3.54、2.56和3.28。PN具有疏水性，在逐級(jí)提升負(fù)荷期間，較高的PN/PS比值可以有效保證污泥的穩(wěn)定性。重新穩(wěn)定后，各層EPS中PN/PS的比值變小，分別為1.69、1.79和3.13。PN和PS攜帶相反的電荷基團(tuán)，經(jīng)更高負(fù)荷沖擊后，為避免過(guò)高VFA濃度可能導(dǎo)致的生物膜解體，EPS組分中PN/PS比值變小可以有效減少聚集體間的靜電排斥力，從而使生物膜更加密實(shí)，以應(yīng)對(duì)高負(fù)荷環(huán)境對(duì)生物膜體系的影響。

2.3厭氧生物膜群落特性

1)門(mén)水平群落特性。門(mén)水平上菌群分布結(jié)果如圖6所示。經(jīng)馴化后，優(yōu)勢(shì)菌(相對(duì)豐度>7%)從Desulfobacterota(21.1%)、Proteobacteria(17.1%)、Chloroflexi(13.7%)、Bacteroidota(11.8%)和Firmicutes(10.3%)演替為Bacteroidota(22.4%)、Chloroflexi(19.5%)、Halobacterota(11.8%)、Euryarchaeota(11.7%)和Proteobacteria(7.4%)，這表明進(jìn)水基質(zhì)組分將顯著影響微生物群落結(jié)構(gòu)。在OLR從1.2g·(L·d)?1增至9.6g·(L·d)?1期間，優(yōu)勢(shì)菌Proteobacteria(P>0.05)、Desulfobacterota(P<0.05)和Spirochaetota(P<0.05)豐度隨OLR提升而增加。Halobacterota(P<0.05)和Chloroflexi(P>0.05)豐度隨OLR提升而減少。Proteobacteria、Chloroflexi、Spirochaetota和Bacteroidota是中溫厭氧體系中常見(jiàn)的水解細(xì)菌，可將蛋白質(zhì)和碳水化合物降解為VFAs或乙醇等物質(zhì)。Firmicutes和Euryarchaeota豐度呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，而B(niǎo)acteroidota豐度則是先減后增。這說(shuō)明，在低OLR下，F(xiàn)irmicutes更易表現(xiàn)出高聚集性；在高OLR下，Bacteroidota生物活性更高。在釀造工序中會(huì)添加SO2抑制細(xì)菌，SO2氧化后以硫酸鹽的形式存在于廢水中，Desulfobacterota可將硫酸鹽轉(zhuǎn)化為硫化氫。

圖6 生物膜群落門(mén)水平上的相對(duì)豐度(豐度>2%)

Halobacterota和Euryarchaeota均為產(chǎn)甲烷古菌門(mén)。當(dāng)OLR為1.2、5.4和9.6g·(L·d)?1時(shí)，菌群中古菌門(mén)整體相對(duì)豐度分別約為22.5%、26.7%和16.5%。這表明，在OLR從1.2g·(L·d)?1增至5.4g·(L·d)?1期間，產(chǎn)甲烷古菌得到了富集，增強(qiáng)了AnSBBR的消化性能和穩(wěn)定性。在負(fù)荷進(jìn)一步提升后，豐度明顯下降，說(shuō)明高負(fù)荷環(huán)境對(duì)部分產(chǎn)甲烷古菌存在抑制效果。

2)屬水平群落特性。接種污泥經(jīng)馴化后，Methanobacterium(11.7%)、Methanosarcina(10.3%)、Anaerolineaceae_UCG-001(5.9%)、Longilinea(5.5%)和Leptolinea(4.3%)成為主要的菌屬(圖7)。Methanobacterium是利用H2/CO2產(chǎn)生CH4的嗜氫產(chǎn)甲烷菌，Methanosarcina是可同時(shí)利用乙酸、H2/CO2和甲基三種底物的產(chǎn)甲烷菌。因二者均屬r策略菌，具備世代時(shí)間短、比生長(zhǎng)速率高的特性，在馴化后豐度明顯增加。Anaerolineaceae_UCG-001、Longilinea和Leptolinea可轉(zhuǎn)化多糖等碳水化合物為乙酸，葡萄酒生產(chǎn)廢水中豐富的有機(jī)物促進(jìn)了菌屬的增殖。

圖7 生物膜群落屬水平上的相對(duì)豐度(豐度>1%)

在OLR從1.2g·(L·d)?1增至9.6g·(L·d)?1期間，主要存在4種古菌屬和8種細(xì)菌屬(相對(duì)豐度>3%)。Methanosarcina、Anaerolineaceae_UCG-001和Longilinea豐度隨OLR提升而減少(P>0.05)；Methanobrevibacter與Paludibacter(P>0.05)，Desulfovibrio與Treponema(P<0.05)豐度隨OLR提升而增加；Methanobacterium、Acinetobacter和Brevinema豐度呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，Methanosaeta豐度變化與之相反。

在OLR從1.2g·(L·d)?1增至5.4g·(L·d)?1后，Methanobacterium豐度由11.7%增至17.1%，Methanosaeta豐度由1.4%增至5.3%，Desulfovibrio豐度由0.8%增至5.6%，Brevinema豐度由0.01%增至4.6%，Methanosarcina豐度由10.3%降至3.7%，Anaerolineaceae_UCG-001豐度由5.9%降至1.7%，Longilinea豐度由5.5%降至1.3%。研究顯示，專(zhuān)性嗜乙酸產(chǎn)甲烷菌Methanosaeta在較低的OLR下對(duì)乙酸的利用率更高，從而抑制了Methanosarcina的生長(zhǎng)。Desulfovibrio是典型的乙醇氧化菌，能夠代謝包括乙醇在內(nèi)的多種碳水化合物，隨進(jìn)水有機(jī)物濃度的增加而逐漸富集。

在OLR從5.4g·(L·d)?1增至9.6g·(L·d)?1后，Desulfovibrio豐度由5.6%增至12.4%，Paludibacter豐度由1.3%增至5.8%，Methanobrevibacter豐度由0.02%增至3.3%，Treponema豐度從1.3%增至4.3%，Methanobacterium豐度由17.1%降至8.3%，Methanosaeta豐度由5.3%降至1.8%。Desulfovibrio進(jìn)一步富集后，與Methanosaeta和Methanosarcina競(jìng)爭(zhēng)基質(zhì)中的乙酸，又因Methanosarcina可利用多種基質(zhì)代謝，故受到的影響明顯小于Methanosaeta。Paludibacter為產(chǎn)酸菌，可利用多種單糖和二糖產(chǎn)生乙酸、丙酸，Treponema參與同型產(chǎn)乙酸過(guò)程。Methanobrevibacter可通過(guò)產(chǎn)生氧化型NAD+載體來(lái)提高產(chǎn)甲烷活性，并且在高OLR下生物活性更高。

當(dāng)OLR為1.2、5.4和9.6g·(L·d)?1時(shí)，菌群中整體古菌屬相對(duì)豐度分別約為23.4%、26.3%和16.2%；當(dāng)OLR為5.4g·(L·d)?1時(shí)，產(chǎn)甲烷古菌整體豐度最大并且存在Methanosphaerula(0.2%)等其他產(chǎn)甲烷菌。產(chǎn)甲烷過(guò)程作為厭氧消化的限速步驟，產(chǎn)甲烷菌的豐度越大、種類(lèi)越多，越有利于提高生物膜體系的消化性能和應(yīng)對(duì)潛在環(huán)境變化的能力。

3、結(jié)論

1)在滿足出水COD低于200mg·L?1的前提下，AnSBBR可有效處理OLR為1.2~9.6g·(L·d)?1的葡萄酒生產(chǎn)廢水。OLR為5.4g·(L·d)?1時(shí)，運(yùn)行性能最佳，COD去除率為(97.2±0.5)%，甲烷產(chǎn)量和甲烷產(chǎn)率分別為20.2L·d?1和(349.9±7.6)mL·g?1。

2)與OLR為1.2g·(L·d)?1相比，OLR為9.6g·(L·d)?1時(shí)，產(chǎn)甲烷速率提高69.3%，生物膜量增加294.3%，輔酶F420濃度增加190.8%以及INT-ETS活性提高88.4%。這說(shuō)明，逐級(jí)提升OLR的運(yùn)行策略可促進(jìn)厭氧生物膜體系的生長(zhǎng)。

3)高通量測(cè)序顯示，群落中主要細(xì)菌為Desulfovibrio、Brevinema、Treponema、Longilinea、Paludibacter和Leptolinea，主要古菌為Methanobacterium、Methanobrevibacter，Methanosaeta和Methanosarcina，其相對(duì)豐度隨負(fù)荷的提升發(fā)生變化。當(dāng)OLR為5.4g·(L·d)?1時(shí)，產(chǎn)甲烷菌整體豐度最大且多樣性更高；當(dāng)OLR為9.6g·(L·d)?1時(shí)，培養(yǎng)出特定的菌屬(Methanobrevibacter)來(lái)適應(yīng)環(huán)境。